脫氫乙酸(DHA)是一種高效的防腐、防霉劑,在酸、堿條件下均有一定的抑菌能力,尤其對(duì)酵母、細(xì)菌、霉菌有較強(qiáng)的抑制能力,常用于果汁、醬菜、糕點(diǎn)、淀粉制品、肉制品、發(fā)酵豆制品、復(fù)合調(diào)味料等食品和食品添加劑防腐、防霉。但因其毒性及對(duì)人體健康的危害,對(duì)其含量的檢測(cè)日益受到人們的重視。本文針對(duì)DHA的多種檢測(cè)方法進(jìn)行闡述,旨在為DHA的檢測(cè)研發(fā)提供一定的參考。 
 脫氫乙酸學(xué)名3-乙酰基-6-甲基-脫(2)氫吡喃-2,4脫(3)氫二酮,是繼苯甲酸、山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸酯類之后又一代新的廣譜食品防腐防霉劑,它基本不受pH的影響,抑菌能力很強(qiáng),尤其對(duì)酵母、細(xì)菌、霉菌有較強(qiáng)的抑制能力,常用于果汁、醬菜、糕點(diǎn)、淀粉制品、肉制品、發(fā)酵豆制品、復(fù)合調(diào)味料等食品和食品添加劑防腐、防霉。工業(yè)上還用于飼料、日用化妝品、纖維制品、醫(yī)藥以及齒科材料的防腐。但是脫氫乙酸半數(shù)至死量大鼠口服為1000mg/kg體重,大量食用脫氫乙酸對(duì)人體健康將產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。許多國(guó)家對(duì)脫氫乙酸在食品中的使用量都有明確的規(guī)定:日本規(guī)定其在食品中添加量不得超過(guò)0.5g/kg;美國(guó)規(guī)定其在食品中最高殘留限量為65mg/kg。我國(guó)《GB 2760-2011 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定:脫氫乙酸可用于果汁、醬菜、糕點(diǎn)、淀粉制品、肉制品、發(fā)酵豆制品等幾類食品,最大使用量為0.3~1.0mg/kg。因而,準(zhǔn)確地測(cè)定食品中脫氫乙酸的含量,有利于指導(dǎo)企業(yè)生產(chǎn),規(guī)范企業(yè)行為;同時(shí)也有利于維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益,減少不良危害。 
 檢測(cè)食品中脫氫乙酸的國(guó)標(biāo)方法有氣相色譜法、液相色譜法等,方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在多種樣品前處理方法上進(jìn)行改進(jìn),并相對(duì)應(yīng)建立有效的氣相色譜、液相色譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等檢測(cè)方法,為今后食品中脫氫乙酸的檢測(cè)研發(fā)提供一定的參考。 
 1、氣相色譜法 
 該方法是在GB/T 5009.121-2003《食品中脫氫乙酸的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)方法上進(jìn)行改進(jìn):將樣品酸化后,用乙醚提取脫氫乙酸后濃縮,用氣相色譜(附氫火焰離子化檢測(cè)器)進(jìn)行分離測(cè)定,與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。 
 1.1實(shí)驗(yàn)部分 
 1.1.1儀器與主要試劑 
 氣相色譜儀:GC-17(附氫火焰離子化檢測(cè)器 FID),譜析科學(xué)儀器公司。 
 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥99.6%,購(gòu)自美國(guó)。 
 乙醚:色譜純,重蒸。 
 丙酮:色譜純,重蒸。 
 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品50mg,以丙酮溶解定容于50mL容量瓶中,再以丙酮分別稀釋至1μg/mL、10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL 120μg/mL、160μg/mL 200μg/mL,配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。 
 色譜條件: 
 色譜柱:DB-5毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm); 
 分流比:10:1,柱流速1.0mL/min 
 進(jìn)樣口溫度:250℃、檢測(cè)器溫度:300℃、柱溫165℃; 
 氣流條件:氫氣50mL/min、空氣400mL/min、氮?dú)?0mL/min。 
 應(yīng)用上述色譜條件,脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣,色譜圖如下: 
 1.1.1樣品處理 
 稱取5~10g試樣(準(zhǔn)確至0.0001g),加10mL飽和氯化鈉溶液,2mL鹽酸溶液(1+1)酸化,分別以50mL、20mL、20mL乙醚提取三次,合并乙醚層于100mL容量瓶中定容后,分別用20mL飽和氯化鈉溶液、50mL碳酸氫鈉溶液(10g/L)各洗滌一次,加10g無(wú)水硫酸鈉,室溫下放置30min,取50mL在60℃水浴下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干,用丙酮定容后供氣相色譜測(cè)定。 
 1.1方法討論 
 1.1.1色譜條件的選擇 
 脫氫乙酸用氣相色譜法測(cè)定,與其他同類功能的防腐劑如山梨酸、苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸酯類都有很好的分離度,且在非極性柱、弱極性柱和極性柱中都有很好的響應(yīng)值。但在實(shí)驗(yàn)顯示,脫氫乙酸在非極性柱中因低柱溫有色譜峰拖尾現(xiàn)象,在極性柱中因柱流失有基線漂移現(xiàn)象,為使定性定量準(zhǔn)確,選用了弱極性柱DB-5。 
 1.1.1線性關(guān)系 
 在本實(shí)驗(yàn)條件下,脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.5~100μg/mL范圍內(nèi)與響應(yīng)值峰面積有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r=0.99995。脫氫乙酸的最低檢出濃度為0.2μg/mL。 
 1.1.1準(zhǔn)確度與精密度 
 選用含脫氫乙酸的辣椒醬樣品,在樣品中添加不同濃度的脫氫乙酸標(biāo)液,按本方法測(cè)定,每一濃度重復(fù)測(cè)定6次,取平均值,計(jì)算平均回收率及變異系數(shù),結(jié)果見下表。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本方法回收率滿意,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍小于10%,重復(fù)性好,符合檢測(cè)要求。 
 加標(biāo)濃度(mg/kg) 平均回收率(%) 精密度 RSD(%) 1.0 83.2 6.8    5.0 89.6 5.6   10.0 90.3 4.7    30.0 91.6 3.6     50.0 102.4 3.4 
 2、液相色譜法 
 該方法是在GB/T 23377-2009《食品中脫氫乙酸的測(cè)定 高效液相色譜法》標(biāo)準(zhǔn)方法上進(jìn)行改進(jìn):用氫氧化鈉溶液提取試樣中的脫氫乙酸,經(jīng)脫脂、去蛋白處理后,用高效液相色譜紫外檢測(cè)器測(cè)定,與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。 
 2.1實(shí)驗(yàn)部分 
 2.1.1儀器與主要試劑 
 液相色譜儀:LC-3000(二級(jí)管陣列檢測(cè)器 DAD),譜析科學(xué)儀器公司。 
 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥99.6%,國(guó)標(biāo)公司。   甲醇:色譜純。 
 乙酸銨溶液(0.02mol/L):分析純,稱取1.54g乙酸銨用氨水(1+1)調(diào)節(jié)pH至9.0,加水至1000mL溶液,經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾。 
 2.1.2色譜條件 
 色譜柱:ECOSIL-C18柱 (5μm,250mm×4.6mm); 
 流動(dòng)相:甲醇+0.02mol/L乙酸銨(5+95,v/v) 
 流速:1.0mL/min 
 柱溫:40℃ 
 檢測(cè)波長(zhǎng):293nm 
 應(yīng)用上述色譜條件,脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣,色譜圖如下: 
 2.1.3樣品處理 
 稱取5~10g試樣(準(zhǔn)確至0.0001g),加50mL水,用氫氧化鈉溶液(8g/L)調(diào)節(jié)pH至7.2,加入5mL乙酸鋅溶液(220g/L),5mL亞鐵氰化鉀溶液(106g/L),超聲提取40min,定容至100mL,靜置30min過(guò)0.45μm濾膜,供液相色譜測(cè)定。 
 2.2方法討論 
 2.2.1色譜條件選擇 
 在GB/T 23377-2009國(guó)標(biāo)方法中,流動(dòng)項(xiàng)的選擇為甲醇+0.02mol/L乙酸銨(10+90,v/v)。在實(shí)際樣品的檢測(cè)中,考慮到食品中其他添加劑對(duì)于脫氫乙酸檢測(cè)(如山梨酸、糖精鈉等)的影響,能過(guò)對(duì)不同比例流動(dòng)相的實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相比例為甲醇+0.02mol/L乙酸銨(5+95,v/v)優(yōu)于國(guó)標(biāo)方法條件,結(jié)果見下表。 
 2.2.2線性關(guān)系 
 在本實(shí)驗(yàn)條件下,脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.5~100μg/mL范圍內(nèi)與響應(yīng)值峰面積有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r=0.99999。脫氫乙酸的最低檢出濃度為0.1μg/mL。 
 2.2.3準(zhǔn)確度與精密度 
 參照1.2.3,選用同一辣椒醬樣品,按本方法測(cè)定,做加標(biāo)實(shí)驗(yàn),每一濃度重復(fù)測(cè)定6次,結(jié)果見下表。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本方法回收率滿意,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍小于10%,重復(fù)性好,符合檢測(cè)要求。 
 3、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法 
 目前尚無(wú)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定食品中脫氫乙酸的國(guó)標(biāo)方法,筆者是根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)建立的方法:試樣經(jīng)乙醚提取,用氣相色譜進(jìn)行分離,特征離子峰進(jìn)行定性定量。 
 3.1實(shí)驗(yàn)部分 
 3.1.1儀器與主要試劑 
 氣質(zhì)聯(lián)用儀:GCMS-7890A-5975C,美國(guó)安捷倫公司。 
 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥99.6%,購(gòu)自美國(guó)。 
 正已烷:分析純。 
 乙醚:色譜純,重蒸。 
 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品50mg,以乙醚溶解定容于50mL容量瓶中,再以乙醚分別稀釋至1μg/mL、10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL 120μg/mL、160μg/mL 200μg/mL,配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。 
 3.1.2色譜條件 
 載氣:高純氦氣(99.999%); 
 色譜柱:DB-5MS毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm); 
 柱流速:1.0 mL/min; 
 汽化室溫度:250℃、柱溫程序:初始溫度150℃,保持0.5min,以10℃/min速率升溫至180℃,保持6min。 
 3.1.3 質(zhì)譜條件 
 傳輸線溫度:220℃;離子源溫度:200℃;離子化方式:EI;電子能量:70eV;延遲時(shí)間2.0 min;檢測(cè)方式:全掃描,質(zhì)量范圍:m/z 25~300。 
 應(yīng)用上述質(zhì)譜條件,脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣,質(zhì)譜圖如下: 
 3.2.1樣品處理 
 稱取5~10g試樣(準(zhǔn)確至0.0001g),加35mL水、2mL氫氧化鈉溶液(20g/L),超聲提取20 min,用水定容至50mL,加10mL正己烷提取一次,棄去正己烷層,再加1mL鹽酸(1+1)酸化,準(zhǔn)確加入10mL乙醚振搖5min,靜置10min,取上清液供質(zhì)譜測(cè)定。 
 3.2方法討論 
 3.2.1質(zhì)譜條件的選擇 
 根據(jù)脫氫乙酸在氣相色譜上的良好響應(yīng)情況,用質(zhì)譜測(cè)定時(shí),仍選用的弱極性柱DB-5MS柱。檢測(cè)方式選擇全掃描、選擇離子掃描皆可,本文選擇了全掃描。 
 3.2.2線性關(guān)系 
 在本實(shí)驗(yàn)條件下,脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液在0.5~100μg/mL范圍內(nèi)與響應(yīng)值峰面積有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r=0.99997。脫氫乙酸的最低檢出濃度為0.2μg/mL。 
 3.2.3準(zhǔn)確度與精密度 
 選用同一辣椒醬樣品,按本方法測(cè)定,做加標(biāo)實(shí)驗(yàn),每一濃度重復(fù)測(cè)定6次,結(jié)果見下表。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本方法回收率滿意,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍小于10%,重復(fù)性好,符合檢測(cè)要求。 
 4、結(jié)論 
 本文探討的三種方法,分離度好,回收率較好,都是食品中脫氫乙酸含量的良好檢測(cè)方法。相比較而言,氣相色譜法與干擾物質(zhì)的分離度好,但樣品前處理較復(fù)雜;液相色譜法樣品前處理簡(jiǎn)便,特征峰定性較差;氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法樣品前處理較氣相色譜法簡(jiǎn)便,定性較色譜更精準(zhǔn),但儀器設(shè)備價(jià)格昂貴難以推廣。